允许保健食品声称的保健功能目录 非营养素补充剂(2020年版)(征求意见稿)

中文名称:允许保健食品声称的保健功能目录 非营养素补充剂(2020年版)(征求意见稿)

(其中包括《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》)

英文名称:Directory of Health Function Available to Claim for Non-Nutrition Supplement Health Food (2020) (Draft)

(Including Functional Evaluation Methods of Health Food (2020) (Draft))

发布时间:2020/11/24

截止时间:2020/12/23

发布单位:国家市场监督管理总局

《允许保健食品声称的保健功能目录 非营养素补充剂

(2020年版)(征求意见稿)》

序号

保健功能

备注

1

有助于增强免疫力功能

推荐性评价方法附后

2

有助于抗氧化功能

3

辅助改善记忆功能

4

缓解视觉疲劳功能

5

清咽润喉功能

6

有助于改善睡眠功能

7

缓解体力疲劳功能

8

耐缺氧功能

9

有助于调节体内脂肪功能

10

有助于改善骨密度功能

11

改善缺铁性贫血功能

12

有助于改善痤疮功能

13

有助于改善黄褐斑功能

14

有助于改善皮肤水份状况功能

15

有助于调节肠道菌群功能

16

有助于消化功能

17

有助于润肠通便功能

18

辅助保护胃粘膜功能

19

有助于维持血脂健康水平(胆固醇/甘油三酯)功能

20

有助于维持血糖健康水平功能

21

有助于维持血压健康水平功能

22

对化学性肝损伤有辅助保护功能

23

对电离辐射危害有辅助保护功能

24

有助于排铅功能





《保健食品功能评价方法(2020年版)

(征求意见稿)》


目 录


第一部分、保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定……………………………………1

一、有助于增强免疫力功能………………………………………………………………………1

二、有助于抗氧化功能……………………………………………………………………………1

三、辅助改善记忆功能……………………………………………………………………………2

四、缓解视觉疲劳功能……………………………………………………………………………3

五、清咽润喉功能…………………………………………………………………………………3

六、有助于改善睡眠功能…………………………………………………………………………4

七、缓解体力疲劳功能……………………………………………………………………………4

八、耐缺氧功能……………………………………………………………………………………5

九、有助于调节体内脂肪功能……………………………………………………………………5

十、有助于改善骨密度功能………………………………………………………………………6

十一、改善缺铁性贫血功能………………………………………………………………………7

十二、有助于改善痤疮功能………………………………………………………………………7

十三、有助于改善黄褐斑功能……………………………………………………………………8

十四、有助于改善皮肤水份状况功能……………………………………………………………8

十五、有助于调节肠道菌群功能…………………………………………………………………8

十六、有助于消化功能……………………………………………………………………………9

十七、有助于润肠通便功能………………………………………………………………………10

十八、辅助保护胃粘膜功能………………………………………………………………………11

十九、有助于维持血脂健康水平(胆固醇/甘油三酯)功能…………………………………...11

二十、有助于维持血糖健康水平功能……………………………………………………………13

二十一、有助于维持血压健康水平功能…………………………………………………………14

二十二、对化学性肝损伤有辅助保护功能………………………………………………………14

二十三、对电离辐射危害有辅助保护功能………………………………………………………15

二十四、有助于排铅功能…………………………………………………………………………16

第二部分 功能学检验方法………………………………………………………………………..17

一、有助于增强免疫力功能检验方法……………………………………………………………17

二、有助于抗氧化功能检验方法…………………………………………………………………30

三、辅助改善记忆功能检验方法…………………………………………………………………51

四、缓解视觉疲劳功能检验方法…………………………………………………………………62

五、清咽润喉功能检验方法………………………………………………………………………65

六、有助于改善睡眠功能检验方法………………………………………………………………71

七、缓解体力疲劳功能检验方法…………………………………………………………………74

八、耐缺氧功能检验方法…………………………………………………………………………80

九、有助于调节体内脂肪功能检验方法…………………………………………………………82

十、有助于改善骨密度功能检验方法……………………………………………………………86

十一、改善缺铁性贫血功能检验方法……………………………………………………………93

十二、有助于改善痤疮功能检验方法……………………………………………………………104

十三、有助于改善黄褐斑功能检验方法…………………………………………………………106

十四、有助于改善皮肤水份状况功能检验方法…………………………………………………108

十五、有助于调节肠道菌群功能检验方法………………………………………………………110

十六、有助于消化功能检验方法…………………………………………………………………115

十七、有助于润肠通便功能检验方法……………………………………………………………120

十八、辅助保护胃粘膜功能检验方法……………………………………………………………124

十九、有助于维持血脂健康水平(胆固醇/甘油三酯)功能检验方法………………………...128

二十、有助于维持血糖健康水平功能检验方法…………………………………………………134

二十一、有助于维持血压健康水平功能检验方法………………………………………………144

二十二、对化学性肝损伤有辅助保护功能检验方法……………………………………………147

二十三、对电离辐射危害有辅助保护功能检验方法……………………………………………154

二十四、有助于排铅功能检验方法………………………………………………………………162



 

 


第一部分、保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定


1 有助于增强免疫力功能

1.1 试验项目

1.1.1 体重

1.1.2 脏器/体重比值测定:胸腺/体重比值,脾脏/体重比值

1.1.3 细胞免疫功能测定:小鼠脾淋巴细胞转化实验,迟发型变态反应实验

1.1.4 体液免疫功能测定:抗体生成细胞检测,血清溶血素测定

1.1.5 单核—巨噬细胞功能测定:小鼠碳廓清实验,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

1.1.6 NK细胞活性测定

1.2 试验原则

1.2.1 所列指标均为必做项目。

1.2.2 采用正常或免疫功能低下的模型动物进行实验。

1.3 结果判定

有助于增强免疫力功能判定:在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性,可判定该受试样品具有有助于增强免疫力功能作用。

其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性,或任一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性,或任一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核—巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性,或任一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定单核—巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性,可判定NK细胞活性结果阳性。


2 有助于抗氧化功能

2.1 试验项目

2.1.1 动物实验

2.1.1.1 体重

2.1.1.2 脂质氧化产物:丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素(8-Isoprostane)

2.1.1.3 蛋白质氧化产物:蛋白质羰基

2.1.1.4 抗氧化酶:超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶

2.1.1.5 抗氧化物质:还原型谷胱甘肽

2.1.2 人体试食试验

2.1.2.1 脂质氧化产物:丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素(8-Isoprostane)

2.1.2.2 超氧化物歧化酶

2.1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶

2.2 试验原则

2.2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。

2.2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定,动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。

2.2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。

2.2.4 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

2.3 结果判定

2.3.1 动物实验:脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性,可判定该受试样品有助于抗氧化功能动物实验结果阳性。

2.3.2 人体试食试验:脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性,且对机体健康无影响,可判定该受试样品具有有助于抗氧化功能的作用。


3 辅助改善记忆功能

3.1 试验项目

3.1.1 动物实验

3.1.1.1 体重

3.1.1.2 跳台实验

3.1.1.3 避暗实验

3.1.1.4 穿梭箱实验

3.1.1.5 水迷宫实验

3.1.2 人体试食试验

3.1.2.1 指向记忆

3.1.2.2 联想学习

3.1.2.3 图象自由回忆

3.1.2.4 无意义图形再认

3.1.2.5 人像特点联系回忆

3.1.2.6 记忆商

3.2 试验原则

3.2.1 动物实验和人体试食试验为必做项目。

3.2.2 跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验、水迷宫实验四项动物实验中至少应选三项,以保证实验结果的可靠性。

3.2.3 正常动物与记忆障碍模型动物任选其一。

3.2.4 动物实验应重复一次(重新饲养动物,重复所做实验)。

3.2.5 人体试食试验统一使用临床记忆量表。

3.2.6 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3.3 结果判定

3.3.1 动物实验:跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验、水迷宫实验四项实验中任二项实验结果阳性。且重复实验结果一致(所重复的同一项实验两次结果均为阳性),可以判定该受试样品辅助改善记忆功能动物实验结果阳性。

3.3.2 人体试食试验:记忆商结果阳性,可判定该受试样品具有辅助改善记忆功能的作用。


4 缓解视觉疲劳功能

4.1 人体试食试验项目

4.1.1 分别于试食前后进行眼部症状及眼底检查,血、尿常规检查,肝、肾功能检查,症状询问、用眼情况调查;于试验前进行一次胸片、心电图、腹部B超检查。

4.1.2 明视持久度

4.1.3 视力

4.2 试验原则

4.2.1 受试样品试食时间为60天。

4.2.2 所列指标均为必做项目。

4.2.3 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

4.3 结果判定

4.3.1 试验组自身比较或试验组与对照组组间比较,症状改善且症状总积分差异有显著性(P<0.05)。

4.3.2 试验组自身比较或试验组与对照组组间比较,明视持久度差异有显著性(P<0.05),且平均明视持久度提高大于等于10%。

具备4.3.1及4.3.2可判定该受试物具有缓解视觉疲劳功能。


5 清咽润喉功能

5.1 试验项目

5.1.1 动物实验

5.1.1.1 体重  

5.1.1.2 大鼠棉球植入实验

5.1.1.3 大鼠足趾肿胀实验

5.1.1.4 小鼠耳肿胀实验

5.1.2 人体试食试验:咽部症状、体征

5.2 试验原则

5.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

5.2.2 应对临床症状、体征进行观察。

5.2.3 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

5.3 结果判定

5.3.1 动物实验:大鼠棉球植入实验结果阳性,同时大鼠足趾肿胀实验或小鼠耳肿胀实验结果任意一项阳性,可判定该受试样品清咽功能动物实验结果为阳性。

5.3.2 人体试食试验:试食组自身比较及试食组与对照组组间比较,咽部症状及体征有明显改善,症状及体征的改善率明显增加,可判定该受试样品具有清咽润喉功能。


6 有助于改善睡眠功能

6.1 试验项目

6.1.1 体重

6.1.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

6.1.3 戊巴比妥钠(或巴比妥钠)阈下剂量催眠实验

6.1.4 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

6.2 试验原则

6.2.1 所列指标均为必做项目。

6.2.2 需观察受试样品对动物直接睡眠的作用。

6.3 结果判定

延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠(或巴比妥钠)阈下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验三项实验中任二项阳性,且无明显直接睡眠作用,可判定该受试样品具有有助于改善睡眠功能的作用。


7 缓解体力疲劳功能

7.1 实验项目

7.1.1 动物体重

7.1.2 负重游泳实验

7.1.3 血乳酸

7.1.4 血清尿素

7.1.5 肝糖原或肌糖原

7.2 试验原则

7.2.1 动物实验所列指标均为必做项目。

7.2.2 实验前必须对同批受试样品进行违禁药物的检测。

7.2.3 运动实验与生化指标检测相结合。

7.3 结果判定

负重游泳实验结果阳性,血乳酸、血清尿素、肝糖元/肌糖元三项生化指标中任二项指标阳性,可判定该受试样品具有缓解体力疲劳功能的作用。


8 耐缺氧功能

8.1 试验项目

8.1.1 体重

8.1.2 常压耐缺氧实验

8.1.3 亚硝酸钠中毒存活实验

8.1.4 急性脑缺血性缺氧实验

8.2 试验原则

所列指标均为必做项目。

8.3 结果判定

常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验、急性脑缺血性缺氧实验三项实验中任二项实验结果阳性,可判定该受试样品具有耐缺氧功能的作用。


9 有助于调节体内脂肪功能

9.1 试验项目

9.1.1 动物实验

9.1.1.1 体重、体重增重

9.1.1.2 摄食量、摄入总热量

9.1.1.3 体内脂肪重量(睾丸及肾周围脂肪垫)

9.1.1.4 脂/体比

9.1.2 人体试食试验

9.1.2.1 体重

9.1.2.2 腰围、臀围

9.1.2.3 体内脂肪含量

9.2 试验原则

9.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

9.2.2 动物实验中大鼠肥胖模型法和预防大鼠肥胖模型法任选其一。

9.2.3 减少体内多余脂肪,不单纯以减轻体重为目标。

9.2.4 引起腹泻或抑制食欲的受试样品不能作为有助于调节体内脂肪功能食品。

9.2.5 每日营养素摄入量应基本保证机体正常生命活动的需要。

9.2.6 对机体健康无明显损害。

9.2.7 实验前应对同批受试样品进行违禁药物的检测。

9.2.8 以各种营养素为主要成分替代主食的有助于调节体内脂肪功能食品可以不进行动物实验,仅进行人体试食试验。

9.2.9 不替代主食的有助于调节体内脂肪功能试验,应对试食前后的受试者膳食和运动状况进行观察。

9.2.10 替代主食的有助于调节体内脂肪功能试验,除开展不替代主食的设计指标外,还应设立身体活动、情绪、工作能力等测量表格,排除服用受试样品后无相应的负面影响产生。结合替代主食的受试样品配方,对每日膳食进行营养学评估。

9.2.11 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

9.3 结果判定

9.3.1 动物实验:实验组的体重或体重增重低于模型对照组,体内脂肪含量或脂/体比低于模型对照组,差异有显著性,摄食量不显著低于模型对照组,可判定该受试样品动物有助于调节体内脂肪功能实验结果阳性。

9.3.2 人体试食试验:

不替代主食的有助于调节体内脂肪功能受试样品:试食组自身比较及试食组与对照组组间比较,体内脂肪重量减少,皮下脂肪四个点中任两个点减少,腰围与臀围之一减少,且差异有显著性,运动耐力不下降,对机体健康无明显损害,并排除膳食及运动对有助于调节体内脂肪功能作用的影响,可判定该受试样品具有有助于调节体内脂肪功能的作用。

替代主食的有助于调节体内脂肪功能受试样品:试食组试验前后自身比较,其体内脂肪含量减少,皮下脂肪四个点中至少有两个点减少,腰围与臀围之一减少,且差异有显著性(P<0.05),微量元素、维生素营养学评价无异常,运动耐力不下降,情绪、工作能力不受影响,并排除运动对有助于调节体内脂肪功能作用的影响,可判定该受试样品具有有助于调节体内脂肪功能的作用。


10 有助于改善骨密度功能

10.1 试验项目

动物实验:分为方案一(补钙为主的受试物)和方案二(不含钙或不以补钙为主的受试物)两种。

10.1.1 体重

10.1.2 骨钙含量

10.1.3 骨密度

10.2 试验原则

10.2.1 根据受试样品作用原理的不同,方案一和方案二任选其一进行动物实验。

10.2.2 所列指标均为必做项目。

10.2.3 使用未批准用于食品的钙的化合物,除必做项目外,还必须进行钙吸收率的测定;使用属营养强化剂范围内的钙源及来自普通食品的钙源(如可食动物的骨、奶等),可以不进行钙的吸收率实验。

10.3 结果判定

方案一

骨钙含量或骨密度显著高于低钙对照组且不低于相应剂量的碳酸钙对照组,钙的吸收率不低于碳酸钙对照组,可判定该受试样品具有有助于改善骨密度功能的作用。

方案二

不含钙的产品,骨钙含量或骨密度较模型对照组明显增加,且差异有显著性,可判定该受试样品具有有助于改善骨密度功能的作用。

不以补钙为主(可少量含钙)的产品,骨钙含量或骨密度较模型对照组明显增加,差异有显著性,且不低于相应剂量的碳酸钙对照组,钙的吸收率不低于碳酸钙对照组,可判定该受试样品具有有助于改善骨密度功能的作用。


11 改善缺铁性贫血功能

11.1 试验项目

11.1.1 动物实验

11.1.1.1 体重  

11.1.1.2 血红蛋白

11.1.1.3 红细胞压积/红细胞游离原卟啉

11.1.2 人体试食试验

11.1.2.1 血红蛋白

11.1.2.2 血清铁蛋白

11.1.2.3 红细胞内游离原卟啉/血清运铁蛋白饱和度

11.2 试验原则

11.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

11.2.2 针对儿童的人体试食试验,只测血红蛋白和红细胞内游离原卟啉。

11.2.3 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

11.3 结果判定

11.3.1 动物实验:血红蛋白指标阳性,红细胞内游离原卟啉/红细胞压积二项指标一项指标阳性,可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果为阳性。

11.3.2 人体试食试验

11.3.2.1 针对改善儿童缺铁性贫血功能的,血红蛋白和红细胞内游离原卟啉二项指标阳性,可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用。

11.3.2.2 针对改善成人缺铁性贫血功能的,血红蛋白指标阳性,血清铁蛋白、红细胞内游离原卟啉/血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性,可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用。


12 有助于改善痤疮功能

12.1 人体试食试验项目

12.1.1 痤疮数量

12.1.2 皮损状况

12.1.3 皮肤油份

12.2 试验原则

12.2.1 所列的指标均为必做项目。

12.2.2 试验前后应针对固定皮肤范围内的痤疮数量及皮损状况进行分析。

12.2.3 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

12.3 结果判定

试食组痤疮数量明显减少且大于等于20%,皮损程度积分明显减少,差异均有显著性,皮肤油份不显著增加,可判定该受试样品具有有助于改善痤疮功能的作用。


13 有助于改善黄褐斑功能

13.1 人体试食试验项目

13.1.1 黄褐斑面积

13.1.2 黄褐斑颜色

13.2 试验原则

13.2.1 所列的指标均为必做项目。

13.2.2 试验前后应针对固定皮肤范围内的黄褐斑面积及颜色进行分析。

13.2.3 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

13.3 结果判定

试食组黄褐斑面积明显减少且大于等于10%,颜色积分明显下降,差异均有显著性,且不产生新的黄褐斑,可判定该受试样品具有有助于改善黄褐斑功能的作用。


14 有助于改善皮肤水份状况功能

14.1 人体试食试验项目:皮肤水份

14.2 试验原则

14.2.1 皮肤水份值的测定点试验前后应保持一致。

14.2.2 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

14.3 结果判定:试食组皮肤水份明显改善,差异有显著性,可判定该受试样品具有有助于改善皮肤水分状况功能的作用。


15 有助于调节肠道菌群功能

15.1 试验项目

15.1.1 动物实验

15.1.1.1 体重

15.1.1.2 双歧杆菌

15.1.1.3 乳杆菌

15.1.1.4 肠球菌

15.1.1.5 肠杆菌

15.1.1.6 产气荚膜梭菌

15.1.2 人体试食试验

15.1.2.1 双歧杆菌

15.1.2.2 乳杆菌

15.1.2.3 肠球菌

15.1.2.4 肠杆菌

15.1.2.5 拟杆菌

15.1.2.6 产气荚膜梭菌

15.2 试验原则

15.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

15.2.2 正常动物或肠道菌群紊乱模型动物任选其一。

15.2.3 受试样品中含双歧杆菌、乳杆菌以外的其它益生菌时,应在动物和人体试验中加测该益生菌。

15.2.4 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

15.3 结果判定

15.3.1 动物实验:符合以下任一项,可判定该受试样品有助于调节肠道菌群功能动物实验结果阳性。

15.3.1.1 双歧杆菌和/或乳杆菌(或其它益生菌)明显增加,梭菌减少或无明显变化,肠球菌、肠杆菌无明显变化。

15.3.1.2 双歧杆菌和/或乳杆菌(或其它益生菌)明显增加,梭菌减少或无明显变化,肠球菌和/或肠杆菌明显增加,但增加的幅度低于双歧杆菌、乳杆菌(或其它益生菌)增加的幅度。

15.3.2 人体试食试验:符合以下任一项,可判定该受试样品具有有助于调节肠道菌群功能的作用。

15.3.2.1 双歧杆菌和/或乳杆菌(或其它益生菌)明显增加,梭菌减少或无明显变化,肠球菌、肠杆菌、拟杆菌无明显变化。

15.3.2.2 双歧杆菌和/或乳杆菌(或其它益生菌)明显增加,梭菌减少或无明显变化,肠球菌和/或肠杆菌、拟杆菌明显增加,但增加的幅度低于双歧杆菌、乳杆菌(或其它益生菌)增加的幅度。


16 有助于消化功能

16.1 试验项目

16.1.1 动物实验

16.1.1.1 体重、体重增重、摄食量和食物利用率

16.1.1.2 小肠运动实验

16.1.1.3 消化酶测定

16.1.2 人体试食试验

16.1.2.1 儿童方案

16.1.2.1.1 食欲

16.1.2.1.2 食量

16.1.2.1.3 偏食状况

16.1.2.1.4 体重

16.1.2.1.5 血红蛋白含量

16.1.2.2 成人方案

16.1.2.2.1 临床症状观察

16.1.2.2.2 胃/肠运动实验

16.2 试验原则

16.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

16.2.2 根据受试样品的适用人群特点在人体试食试验方案中任选其一。

16.2.3 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

16.3 结果判定

16.3.1 动物实验:动物体重、体重增重、摄食量、食物利用率,小肠运动实验和消化酶测定三方面中任二方面实验结果阳性,可判定该受试样品有助于消化功能动物实验结果阳性。

16.3.2 人体试食试验

16.3.2.1 针对改善儿童消化功能的,食欲、进食量、偏食改善结果阳性,体重和血红蛋白二项指标中任一项指标结果阳性,可判定该受试样品具有有助于消化功能的作用。

16.3.2.2 针对改善成人消化功能的,临床症状明显改善,胃/肠运动实验结果阳性,可判定该受试样品具有有助于消化功能的作用。


17 有助于润肠通便功能

17.1 试验项目

17.1.1 动物实验

17.1.1.1 体重

17.1.1.2 小肠运动实验

17.1.1.3 排便时间

17.1.1.4 粪便重量

17.1.1.5 粪便粒数

17.1.1.6 粪便性状

17.1.2 人体试食试验

17.1.2.1 症状体征

17.1.2.2 粪便性状

17.1.2.3 排便次数

17.1.2.4 排便状况

17.2 试验原则

17.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

17.2.2 除对便秘模型动物各项必测指标进行观察外,还应对正常动物进行观察,不得引起动物明显腹泻。

17.2.3 排便次数的观察时间试验前后应保持一致。

17.2.4 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

17.3 结果判定

17.3.1 动物实验:排粪便重量和粪便粒数一项结果阳性,同时小肠运动实验和排便时间一项结果阳性,可判定该受试样品有助于通便功能动物实验结果阳性。

17.3.2 人体试食试验:排便次数明显增加,同时粪便性状和排便状况一项结果明显改善,可判定该受试样品具有有助于润肠通便功能的作用。


18 辅助保护胃粘膜功能

18.1 试验项目

18.1.1 动物实验

18.1.1.1 体重  

18.1.1.2 胃粘膜损伤大体观察

18.1.1.3 胃粘膜组织病理学检查

18.1.2 人体试食试验

18.1.2.1 临床症状

18.1.2.2 体征

18.1.2.3 胃镜观察

18.2 试验原则

18.2.1 动物实验的体重和胃粘膜损伤大体观察为必做项目,胃粘膜组织病理学检查为选做项目;人体试食试验所列指标均为必做项目。

18.2.2 无水乙醇、消炎痛致急性胃粘膜损伤模型或冰醋酸致慢性胃溃疡模型任选其一进行动物实验。

18.2.3 在进行人体试食试验时,应对受试样品的安全性作进一步的观察。

18.3 结果判定

18.3.1 动物实验:实验组与模型对照组比较,胃粘膜损伤明显改善,可判定该受试样品动物实验结果为阳性。

18.3.2 人体试食试验:试食组与对照组比较,临床症状、体征积分明显减少,胃镜复查结果有改善或不加重,可判定该受试样品具有辅助保护胃粘膜功能的作用。


19 有助于维持血脂健康水平(胆固醇/甘油三酯)功能

根据血脂异常的类型,有助于维持血脂健康水平(胆固醇/甘油三酯)功能按照不同的血脂异常分型设立分类的动物实验和人体试食试验。

19.1 试验项目

19.1.1 根据受试样品的作用机制,分成三种情况

19.1.1.1 有助于维持血脂健康水平功能:同时维持血总胆固醇和血甘油三酯健康水平

19.1.1.2 有助于维持血胆固醇健康水平功能:单纯维持血胆固醇健康水平

19.1.1.3 有助于维持血甘油三酯健康水平功能:单纯维持血甘油三酯健康水平

19.1.2 观察指标

19.1.2.1 体重

19.1.2.2 血清总胆固醇

19.1.2.3 血清甘油三酯

19.1.2.4 血清高密度脂蛋白胆固醇

19.1.2.5 血清低密度脂蛋白胆固醇

19.1.3 人体试食试验

19.1.3.1 血清总胆固醇

19.1.3.2 血清甘油三酯

19.1.3.3 血清高密度脂蛋白胆固醇

19.1.3.4 血清低密度脂蛋白胆固醇

19.2 试验原则

19.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必测项目。

19.2.2 根据受试样品的作用机制,可在动物实验的两个动物模型中任选一项。

19.2.3 根据受试样品的作用机制,可在人体试食试验的三个方案中任选一项。

19.2.4 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

19.3 结果判定

19.3.1 动物实验:

19.3.1.1 混合型高脂血症动物模型

有助于维持血脂健康水平(胆固醇/甘油三酯)功能结果判定:模型对照组和空白对照组比较,血清甘油三酯升高,血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇升高,差异均有显著性,判定模型成立。(1)各剂量组与模型对照组比较,任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低,且任一剂量组血清甘油三酯降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组,可判定该受试样品有助于维持血脂健康水平动物实验结果阳性。(2)各剂量组与模型对照组比较,任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清甘油三酯不显著高于模型对照组,各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组,可判定该受试样品有助于维持血胆固醇健康水平功能动物实验结果阳性。(3)各剂量组与模型对照组比较,任一剂量组血清甘油三酯降低,差异均有显著性,同时各剂量组血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇不显著高于模型对照组,血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组,可判定该受试样品有助于维持血甘油三酯健康水平功能动物实验结果阳性。

19.3.1.2 高胆固醇血症动物模型

模型对照组和空白对照组比较,血清总胆固醇(TC)或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高,差异有显著性,血清甘油三酯(TG)差异无显著性,判定模型成立。各剂量组与模型对照组比较,任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低,差异有显著性,并且各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)不显著低于模型对照组,血清甘油三酯不显著高于模型对照组,可判定该受试样品有助于维持血胆固醇健康水平功能动物实验结果阳性。

19.3.2 人体试食试验

指标判定标准:

有效:TC 降低>10%或降至正常;TG 降低>15%或降至正常;HDL-C 上升>0.104mmol/L。

无效:未达到有效标准者。

19.3.2.1有助于维持血脂健康水平(胆固醇/甘油三酯)功能结果判定

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较,受试者血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇降低,差异均有显著性,同时血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组,试验组总有效率显著高于对照组,可判定该受试样品有助于维持血脂健康水平(胆固醇/甘油三酯)人体试食试验结果阳性。

19.3.2.2 有助于维持血胆固醇健康水平功能结果判定

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较,受试者血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇降低,差异有显著性,同时血清甘油三酯不显著高于对照组,血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组,试验组血清总胆固醇有效率显著高于对照组,可判定该受试样品有助于维持血胆固醇健康水平功能人体试食试验结果阳性。

19.3.2.3 有助于维持血甘油三酯健康水平功能结果判定

试食组自身比较及试食组与对照组组间比较,受试者血清甘油三酯降低,差异有显著性,同时血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇不显著高于对照组,血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组,试验组血清甘油三酯有效率显著高于对照组,可判定该受试样品有助于维持血甘油三酯健康水平功能人体试食试验结果阳性。


20有助于维持血糖健康水平功能

20.1 试验项目

20.1.1 动物实验

分为方案一(胰岛损伤高血糖模型)和方案二(胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型)两种

20.1.1.1 方案一(胰岛损伤高血糖模型)

20.1.1.1.1 体重

20.1.1.1.2 空腹血糖

20.1.1.1.3 糖耐量

20.1.1.2 方案二(胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型)

20.1.1.2.1 体重

20.1.1.2.2 空腹血糖

20.1.1.2.3 糖耐量

20.1.1.2.4 胰岛素

20.1.1.2.5 总胆固醇

20.1.1.2.6 甘油三酯

20.1.2 人体试食试验

20.1.2.1 空腹血糖

20.1.2.2 餐后2小时血糖

20.1.2.3 糖化血红蛋白(HbA1c)或糖化血清蛋白

20.1.2.4 总胆固醇

20.1.2.5 甘油三酯

20.2 试验原则

20.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

20.2.2 根据受试样品作用原理不同,方案一和方案二动物模型任选其一进行动物实验。

20.2.3 除对高血糖模型动物进行所列指标的检测外,应进行受试样品对正常动物空腹血糖影响的观察。

20.2.4 人体试食试验可在临床治疗的基础上进行。

20.2.5 应对临床症状和体征进行观察。

20.2.6 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

20.3 结果判定

20.3.1 动物实验:

    方案一:空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,且对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品有助于维持血糖健康水平动物实验结果阳性。

方案二:空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,血脂(总胆固醇、甘油三酯)无明显升高,且对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品有助于维持血糖健康水平功能动物实验结果阳性。

20.3.2 人体试食试验:空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白(或糖化血清蛋白)、血脂四项指标均无显著升高,且空腹血糖、餐后2小时血糖两项指标中一项指标阳性,对机体健康无不利影响,可判定该受试样品具有有助于维持血糖健康水平功能的作用。

21有助于维持血压健康水平功能

21.1 试验项目

21.1.1 动物实验

21.1.1.1 体重

21.1.1.2 血压

21.1.1.3 心率

21.1.2 人体试食试验

21.1.2.1 临床症状与体征

21.1.2.2 血压

21.1.2.3 心率

21.2 试验原则

21.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

21.2.2 动物实验应选择高血压模型动物和正常动物进行所列指标的观察。

21.2.3 人体试食试验可在临床治疗的基础上进行。

21.2.4 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

21.3 结果判定

21.3.1 动物实验:实验组动物血压明显低于对照组,且对实验组动物心率和正常动物血压及心率无影响,可判定该受试样品有助于维持血压健康水平功能动物实验结果阳性。

21.3.2 人体试食试验:舒张压或收缩压二项指标中任一指标结果阳性,可判定该受试样品具有有助于维持血压健康水平功能的作用。

22 对化学性肝损伤有辅助保护功能

22.1 试验项目

动物实验分为方案一(四氯化碳肝损伤模型)和方案二(酒精肝损伤模型)两种。

22.1.1 方案一(四氯化碳肝损伤模型)

22.1.1.1 体重

22.1.1.2 谷丙转氨酶(ALT)

22.1.1.3 谷草转氨酶(AST)

22.1.1.4 肝组织病理学检查

22.1.2方案二(酒精肝损伤模型)

22.1.2.1 体重

22.1.2.2 丙二醛(MDA)

22.1.2.3 还原型谷胱甘肽(GSH)

22.1.2.4 甘油三酯(TG)

22.1.2.5 肝组织病理学检查

22.2 试验原则

22.2.1 所列指标均为必做项目。

22.2.2 根据受试样品作用原理的不同,方案一和方案二任选其一进行动物实验。

22.3 结果判定

方案一(四氯化碳肝损伤模型):病理结果阳性,谷丙转氨酶和谷草转氨酶二指标中任一项指标阳性,可判定该受试样品具有对化学性肝损伤有辅助保护功能作用。

方案二(酒精肝损伤模型):①肝脏MDA、GSH、TG三项指标结果阳性,可判定该受试样品对乙醇引起的肝损伤有辅助保护功能,②肝脏MDA、GSH、TG三指标中任二项指标阳性,且肝脏病理结果阳性,可判定该受试样品具有对乙醇引起的肝损伤有辅助保护功能作用。

23对电离辐射危害有辅助保护功能

23.1 实验项目

23.1.1 体重

23.1.2 外周血白细胞计数

23.1.3 骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数

23.1.4 小鼠骨髓细胞微核实验

23.1.5 血/组织中超氧化物歧化酶活性实验

23.1.6 血清溶血素含量实验

23.2 实验原则

外周血白细胞计数、骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数、小鼠骨髓细胞微核实验、血/组织中超氧化物歧化酶活性实验、血清溶血素含量实验中任选择三项进行实验。

23.3 结果判定

在外周血白细胞计数、骨髓细胞DNA含量或骨髓有核细胞数、小鼠骨髓细胞微核、血/组织中超氧化物歧化酶活性、血清溶血素含量五项实验中任何二项实验结果阳性,可判定该受试样品具有对电离辐射危害有辅助保护功能的作用。

24 有助于排铅功能

24.1 试验项目

24.1.1 动物实验

24.1.1.1 体重  

24.1.1.2 血铅

24.1.1.3 骨铅

24.1.1.4 肝组织铅

24.1.2 人体试食试验

24.1.2.1 血铅

24.1.2.2 尿铅

24.1.2.3 尿钙

24.1.2.4 尿锌

24.2 试验原则

24.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

24.2.2 应对临床症状、体征进行观察。

24.2.3 对尿铅进行多次测定,以了解体内铅的排出情况。

24.2.4 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

24.3 结果判定

24.3.1 动物实验:实验组与模型对照组比较,骨铅含量显著降低,同时血铅或肝铅含量显著降低,可判定该受试样品动物实验结果为阳性。

24.3.2 人体试食试验:试食组与对照组组间比较,至少两个观察时点尿铅排出量增加且显著高于试验前,或总尿铅排出量明显增加。同时,对总尿钙、总尿锌的排出无明显影响,或总尿钙、总尿锌排出增加的幅度小于总尿铅排出增加的幅度,可判定该受试样品具有有助于排铅功能的作用。


第二部分 功能学检验方法


一、有助于增强免疫力功能检验方法



1. 实验动物

推荐用近交系小鼠,18-22g,单一性别,每组10-15只。


2. 剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个阴性对照组,以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组,另设二个剂量组,必要时设阳性对照组。

受试样品给予时间30天,必要时可延长至45天。免疫模型动物实验时间可适当延长。


3. 实验方法

3.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

可任选下列方法之一

3.1.1 MTT法

3.1.1.1 原理

当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞发生增殖反应,活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色结晶,其光密度值能反映细胞的增殖情况。

3.1.1.2 仪器和材料

RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)

纱布或200目筛网、24孔培养板,96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。

3.1.1.3 实验步骤

3.1.1.3.1 试剂配制

完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌,用前加入10%小牛血清,1%谷氨酰胺(200mmol/L),青霉素(100U/mL),链霉素(100μg/L)及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇,用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2,即完全培养液。

ConA液  用双蒸水配制成100μg/mL的溶液,过滤除菌,在低温冰箱(-20℃)保存。

无菌Hank's液  用前以3.5%的无菌NaHCO3调pH至7.2-7.4。

MTT液  将5mg MTT溶于1mL pH7.2的PBS中,现配现用。

酸性异丙醇溶液  96mL 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl,临用前配制。

3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备

无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank's液平皿中,用镊子轻轻将脾磨碎,制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤,或用4层纱布将脾磨碎,用Hank's液洗2次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),调整细胞浓度为3×106个/mL。

3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应

将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1mL,一孔加75μL ConA 液(相当于7.5μg/mL),另一孔作为对照,置5%CO2,37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7mL,加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入MTT(5mg/mL)50μL /孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1mL酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔作3个平行孔,用酶标仪,以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中,721分光光度计上在波长570nm测定OD值。

3.1.1.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力,受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值,可判定该项实验结果阳性。

3.1.1.5 注意事项

本实验中ConA的浓度很重要,过低不能刺激足够的细胞增殖,过高会抑制细胞增殖,不同批号的ConA在实验前要进行预试,以找到最佳浓度。

3.1.2 同位素掺入法

3.1.2.1 原理

T淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA 等的刺激下,产生增殖反应,DNA和RNA合成明显增加,如在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。

3.1.2.2 仪器和材料

RPMI-1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、Hank's液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)、3H-TdR、闪烁液[2,5-二苯基恶唑(PPO)0.5g、1,4-双-(5-苯基恶唑基)-苯(POPOP)0.25g、二甲苯500mL混匀]

200目筛网,96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。

3.1.2.3 实验步骤

3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备

无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单细胞悬液。经200目筛网过滤,用Hank's液洗3次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×106个/mL。

3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应

将脾细胞悬液加入到96孔培养板中,200μL/孔,每一份脾细胞悬液分装6个孔,3孔加ConA(5μg/mL),另3个孔不加ConA作为对照。置5% CO2,37℃培养72h,培养结束前6h,每孔加入3H-TdR 20μL,使其终浓度为(3.7-18.5)×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中,加入7mL闪烁液,用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。

3.1.2.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

以每分钟脉冲数(cpm)表示增殖程度,用刺激指数(SI)来表示

SI=

受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值,即可判定该项实验结果阳性。

3.2 迟发型变态反应(DTH)

可任选下列方法之一

3.2.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)

3.2.1.1 原理

二硝基氟苯(DNFB)稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原,由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4~7天后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击,使局部肿胀,一般在抗原攻击后24~48h达高峰,其肿胀程度可以反应映迟发型变态反应程度。

3.2.1.2 材料

    DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。

3.2.1.3 实验步骤

3.2.1.3.1 试剂配制

DNFB溶液  DNFB溶液应新鲜配制,称取DNFB50mg,置清洁干燥小瓶中,将预先配好的5mL丙酮麻油溶液(丙酮:麻油=1:1),倒入小瓶,盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后,用250μL注射器通过瓶盖取用。

3.2.1.3.2 致敏  每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛或剃毛,范围约 3cm×3cm,用 DNFB 溶液50μL均匀涂抹致敏。

3.2.1.3.3 DTH的产生与测定  5天后,用DNFB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后 24h 颈椎脱臼处死小鼠,剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片,称重。

3.2.1.4 数据处理与结果判定

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值,可判定该项实验结果阳性。

3.2.1.5 注意事项

    操作时应避免DNFB与皮肤接触。

3.2.2 绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法)

3.2.2.1 原理

    SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞,4天后,当再以SRBC攻击时,攻击部位出现肿胀,其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。

3.2.2.2 材料

    游标卡尺(精密度0.02mm)、SRBC、微量注射器(50μL)。

3.2.2.3 实验步骤

3.2.2.3.1 致敏  小鼠用2%(v/v)SRBC腹腔或静脉免疫,每只鼠注射0.2mL(约1×108个SRBC)。

3.2.2.3.2 DTH的产生与测定  免疫后4天,测量左后足跖部厚度,然后在测量部位皮下注射20%(v/v)SRBC,每只鼠20μL(约1×108个SRBC),注射后于24h测量左后足跖部厚度,同一部位测量三次,取平均值。

3.2.2.4 数据处理和结果判定

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值,可判定该项实验结果阳性。

3.2.2.5 注意事项

    测量足跖厚度时,最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部,但不要加压,否则会影响测量结果。

    攻击时所用的SRBC要新鲜(4℃保存期不超过1周)。

3.3 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

3.3.1 原理

经过绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合,在补体参与下,使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解,形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数可反映抗体生成细胞数。

3.3.2 仪器和材料

    二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC、补体(豚鼠血清)、Hank's液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。

3.3.3 实验步骤

3.3.3.1 SRBC  绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。

3.3.3.2 制备补体  采集豚鼠血,分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清),将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中,4℃冰箱放置30min,经常振荡,离心取上清,分装,-70℃保存。用时以SA缓冲液按1:8-15稀释。

3.3.3.3 玻片涂膜  在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖(0.5g琼脂糖加双蒸水至100mL,加热溶解),干后可长期保存备用。

3.3.3.4 免疫动物  取脱纤维的羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min,计数细胞,每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC 5×107~2×108个。也可将压积SRBC 用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2mL。

3.3.3.5 脾细胞悬液制备

    将SRBC免疫4~5天后的小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏,放在盛有Hank's液的小平皿内,轻轻磨碎脾脏,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,或用4层纱布将脾磨碎,离心(1000r/min)10min,用Hank's液洗2遍,最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中,计数细胞,并将细胞浓度调整为5x106个/mL。也可将细胞悬浮在8mL Hank's液。

3.3.3.6 空斑的测定

    将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后,放45~50℃水浴保温,与等量pH7.2~7.4、2倍浓度的Hank's液混合,分装小试管,每管0.5mL,再向管内加50μL 10% SRBC(v/v,用SA缓冲液配制),20μL脾细胞悬液(5×106个/mL)或25μL脾细胞悬液,迅速混匀,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上,做平行片,待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入二氧化碳培养箱中孵育1~1.5h,然后用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入到玻片架凹槽内,继续温育1~1.5h后,计数溶血空斑数。

3.3.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

用空斑数/105脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示,受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数,可判定该项实验结果阳性。

3.4 血清溶血素的测定

    可任选下列方法之一。

3.4.1 血凝法

3.4.1.1 原理

    用SRBC免疫动物后,产生抗SRBC抗体(溶血素),利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。

3.4.1.2 仪器和材料

    SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机

3.4.1.3 实验步骤

3.4.1.3.1 SRBC  绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。

3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离  取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4~5天后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。

3.4.1.3.3 凝集反应  用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内,每孔100μL,再加入100μL 0.5%(v/v)的SRBC悬液,混匀,装入湿润的平盘内加盖,于37℃温箱孵育3h,观察血球凝集程度。

3.4.1.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

血清凝集程度一般分为5级(0-IV)记录,按下式计算抗体积数,受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平,可判定该项实验结果阳性。

抗体水平=(S1+2S2+3S3……nSn)

式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数,S代表凝集程度的级别,抗体积数越大,表示血清抗体越高。

0级  红细胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圆点状,四周液体清晰。

I级  红细胞大部分沉集在孔底成园点状,四周有少量凝集的红细胞。

II级  凝集的红细胞在孔底形成薄层,中心可以明显见到一个疏松的红点。

III级  凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。

IV级  凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,凝块有时成卷折状。

3.4.1.5 注意事项

    血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。

3.4.2 半数溶血值(HC50)的测定

3.4.2.1 原理

    用SRBC免疫动物后,血清中出现SRBC抗体(溶血素),在补体参与下,与SRBC一起孵育,可发生溶血反应,释放血红蛋白,通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。

3.4.2.2 仪器和材料

    721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、都氏试剂(碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g,加蒸馏水至1000mL)

3.4.2.3 实验步骤

3.4.2.3.1 SRBC  绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。

3.4.2.3.2 制备补体  采集豚鼠血,分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清),将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中,放4℃冰箱30min,经常振荡,离心取上清,分装,-70℃保存。用时以SA液按1:8稀释。

3.4.2.3.3 免疫动物及血清分离  取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4~5天后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,使血清充分析出,2000r/min离心10min,或6000r/min,4min,收集血清。

3.4.2.3.4 溶血反应 

3.4.2.3.4.1 分光光度计法 取血清用SA缓冲液稀释(一般为200~500倍)。将稀释后的血清1mL置试管内,依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL,补体1mL(用SA液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温15~30min后,冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL,加都氏试剂3mL,同时取10%(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL,充分混匀,放置10min后,于540nm处以对照管作空白,分别测定各管光密度值。

3.4.2.3.4.2 酶标仪法 设样品孔和空白对照孔,样品孔:取血清用SA缓冲液稀释(一般200~500倍);每孔加入稀释后的血清50μL;空白对照孔:每孔加入50μLSA缓冲液,再依次加入10%(v/v)SRBC 25μL,补体50μL(用SA溶液按1:8稀释),置37℃恒温培养箱中保温30min,冰浴终止反应,1500r/min水平离心10min,然后样品孔和空白对照孔各取上清液50μL加入另一个96孔培养板内,加都氏试剂150μL。同时设半数溶血孔,加入10%(v/v)SRBC 12.5μL再加都氏试剂至200μL。用震荡器充分混匀,放置10min后,于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。

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